Flujo de trabajo de gradiente para seccionar CUBE para la generación e imágenes de organoides con diferenciación localizada

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 299 (2023) Citar este artículo

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Los avances en el cultivo de organoides han dado lugar a varios miniórganos in vitro que imitan los tejidos nativos de muchas maneras. Sin embargo, el cuello de botella sigue siendo generar organoides complejos con patrones de ejes corporales, así como mantener la orientación de los organoides durante los procesos de análisis posteriores al experimento. Aquí, presentamos un flujo de trabajo para cultivar organoides con gradiente de morfógeno utilizando un dispositivo de cultivo CUBE, seguido de la sección de muestras con el CUBE para retener información sobre la dirección del gradiente. Mostramos que los esferoides hiPSC cultivados con dos medios de diferenciación separados en extremos opuestos del CUBE dieron como resultado expresiones localizadas de los respectivos marcadores de diferenciación, en contraste con la distribución homogénea de marcadores en los controles. También describimos los procesos para el corte criogénico y en parafina de esferoides en CUBE para retener la información de orientación del gradiente. Este flujo de trabajo desde el cultivo en gradiente hasta la sección con CUBE puede proporcionar a los investigadores una herramienta conveniente para generar organoides cada vez más complejos y estudiar sus procesos de desarrollo in vitro.

Las células madre pluripotentes (PSC) y los organoides derivados de ellas ofrecen una forma pragmática de modelar y estudiar la formación de tejidos y órganos durante el desarrollo humano temprano, ya que los especímenes reales plantean cuestiones éticas desafiantes1,2,3,4. Los protocolos para generar los diversos organoides que imitan los tejidos nativos generalmente se basan en la manipulación secuencial de la activación o inhibición de vías de señalización como Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt o BMP en diferentes momentos para inducir la diferenciación hacia linajes específicos, como en el generación de organoides de intestino5, riñón6 y pulmón7, epiblastos8,9 y gastruloides10.

Sin embargo, controlar el crecimiento y la diferenciación de las células a lo largo de un eje corporal sigue siendo un desafío en los cultivos de organoides 3D. In vitro, el patrón anteroposterior y dorsal-ventral en los organoides puede surgir mediante la autoorganización celular11,12, o lograrse mediante la fusión de organoides diferenciados por separado como un ensambleide, como en los organoides cerebrales con diferentes regiones cerebrales o en los organoides biliares con hígado, sistema biliar. componentes del tracto y del páncreas13,14. Sin embargo, la limitación de estos métodos es que debido a que las células se cultivan en un medio uniforme único, el nivel de control en términos de información espacial suministrada a las células es bastante bajo; Todas las células dentro del grupo de células que forman el organoide reciben las mismas señales de diferenciación de las moléculas de señalización en el medio. In vivo, por otro lado, los gradientes de concentración de morfógenos de otras fuentes también contribuyen a determinar hacia dónde van las células y qué fenotipo o patrón deben adoptar durante el desarrollo15,16. Por ejemplo, la formación del tubo neural depende de señales de la notocorda y de la capa de ectodermo no neural17, y las nefronas del riñón se desarrollan mediante el intercambio de diversas señales entre la yema ureteral y el mesénquima metanéfrico18. Por lo tanto, existe la necesidad de replicar gradientes de morfógenos para generar organoides que se parezcan más a los tejidos nativos in vivo.

Se han desarrollado varias tecnologías de ingeniería para imitar el suministro de gradientes espaciales de moléculas de señalización a las células in vitro. Las PSC diseñadas para expresar Sonic Hedgehog (Shh)19 o perlas de agarosa empapadas con morfógenos20 se pueden colocar cerca del organoide en desarrollo y la difusión de moléculas desde la fuente hasta las células en diferenciación creó un gradiente de concentración de morfógenos de alto a bajo. Además, también se han desarrollado varios transwells y microdispositivos modificados que permiten cultivar células con dos compartimentos de medios separados para generar gradientes de morfógeno en direcciones opuestas a través de las células21,22,23,24,25,26. Sin embargo, estas tecnologías no están exentas de inconvenientes: (1) requieren procedimientos complicados de preparación y configuración que no son fáciles de realizar en la mayoría de los laboratorios de biología sin habilidades y equipos especializados, (2) carecen de control sobre la colocación y posicionamiento de los muestra en el dispositivo, y (3) es difícil recuperar la muestra del dispositivo después del experimento para análisis adicionales sin causar mucho daño a la muestra o perder la orientación de la muestra. En particular, la capacidad de retener información sobre la orientación del gradiente al que estaban sujetas las células es fundamental para garantizar un análisis adecuado de la muestra.

Por lo tanto, nuestro objetivo fue abordar estos problemas mediante el desarrollo de una plataforma de cultivo de gradiente simple y fácil de usar para controlar la diferenciación de PSC en organoides con patrones localizados distintos, al tiempo que se conserva la integridad de la muestra y la orientación del gradiente para los procesos de análisis de imágenes. Para lograr esto, utilizamos un dispositivo de cultivo CUBE desarrollado previamente para mejorar la capacidad de manipulación de muestras cultivadas en hidrogel ECM y la repetibilidad de la siembra celular y la formación de patrones27,28. Debido a la simplicidad del dispositivo CUBE, que comprende un marco simple de material duro con paredes transparentes que permiten la visibilidad de la muestra en su interior, el diseño y la composición del CUBE se pueden adaptar fácilmente para adaptarse a los requisitos del experimento. Por ejemplo, en este estudio, el diseño del marco se modificó para garantizar la estanqueidad integrada con un dispositivo fluídico, y el material del marco se eligió para que fuera compatible con los reactivos orgánicos utilizados en el procesamiento de muestras posterior al experimento. Aquí, primero mostramos cómo podemos colocar con precisión los esferoides de células iPSC en la posición deseada en el CUBO. Luego, demostramos la facilidad con la que se puede generar gradiente en CUBE para inducir la diferenciación localizada de iPSC simplemente transfiriéndolo a un dispositivo de chip de gradiente de dos compartimentos sin la necesidad de configurar sistemas de bomba complicados. Finalmente, presentamos la compatibilidad de la plataforma de gradiente con diferentes métodos de procesamiento posteriores al experimento (sección criogénica y en parafina) para imágenes y análisis manteniendo al mismo tiempo la información de orientación del gradiente (Fig. 1). Con este flujo de trabajo de Gradient-in-CUBE, se pueden lograr organoides con diferenciación controlada del eje corporal, proporcionando modelos in vitro cada vez más complejos en los que podemos aplicar y estudiar sistemáticamente los efectos de los gradientes de morfógenos para dirigir la diferenciación y el desarrollo celular en tejidos, órganos, y, finalmente, los sistemas corporales para mejorar nuestra comprensión de los procesos de desarrollo en el ser humano.

El concepto de este trabajo fue utilizar el dispositivo de cultivo CUBE para, en primer lugar, controlar la posición de siembra de las células en la ubicación deseada, luego transferir el CUBE a un chip Gradient-in-CUBE para cultivar células con un gradiente de morfógeno y, finalmente, seccione la muestra con el CUBO para mantener la información de orientación del gradiente en las secciones.

Los gradientes de señalización de morfógenos contribuyen a la especificación y el patrón del destino celular en los tejidos en desarrollo29, y recapitular este fenómeno in vitro podría promover el desarrollo de modelos de organoides cada vez más complejos. Sin embargo, la diferenciación mediante señales de gradiente es difícil de lograr en organoides que se cultivan en un medio uniforme único en una placa de pocillos y dependen principalmente de la autoorganización para la creación de patrones30. Aunque ha habido muchos informes sobre métodos para cultivar organoides con gradientes de morfógenos19,20,31, la configuración complicada y la mala capacidad de manejo de muestras, así como el mantenimiento de la orientación del gradiente durante el análisis, limitan su adopción generalizada por parte de la comunidad de organoides. Aprovechando la capacidad de fácil manejo del dispositivo CUBE, establecimos un flujo de trabajo desde el cultivo de organoides con gradiente de morfógeno hasta imágenes de muestras con orientación de gradiente, con los siguientes procesos: (1) controlar la posición de siembra inicial de las células en el CUBE que permiten células para recibir información de gradiente consistente en cada experimento, (2) generar un gradiente de señalización de morfógeno a lo largo de un eje de la muestra de células y (3) seccionar la muestra con el CUBO para retener información de la dirección del gradiente.

La ubicación precisa de las células en el CUBO es importante para garantizar la coherencia en la señalización del gradiente que reciben las células. Por ejemplo, la información de gradiente detectada por las celdas que se colocaron demasiado cerca de un extremo del CUBO será diferente de la detectada por las celdas en el centro del CUBO. Para controlar la posición de siembra de las células en el CUBE, se utiliza una tapa de molde con una estructura de pilar para crear un bolsillo de siembra en la posición deseada en el hidrogel en el CUBE, así como ranuras para garantizar el ajuste preciso de la tapa del molde en el CUBE. fue diseñado (Fig. 2b (i)). El proceso para crear una bolsa de siembra y esferoides de células de semilla en la bolsa se ilustra en la Fig. 2b (ii) y se describe en la sección de métodos. Al utilizar este método de siembra, las células siempre se pueden sembrar en la ubicación deseada con baja variación, en comparación con el posicionamiento manual de las células sin una guía, lo que da como resultado una siembra inexacta con alta variación (Figura complementaria 1). Aunque se podría argumentar que una persona altamente capacitada o un robot pueden posicionar células en el gel no curado con alta precisión sin la necesidad de la tapa del molde, el comportamiento de gelificación de hidrogeles blandos como el colágeno o Matrigel puede variar mucho dependiendo Depende de la temperatura y la manipulación de la muestra, y es difícil predecir cuándo el gel se habrá polimerizado lo suficiente como para mantener las células en su posición. Para resaltar la facilidad con la que cualquiera puede utilizar este método, reclutamos a nuestra secretaria de laboratorio y a un estudiante de secundaria, quienes no tenían experiencia en el uso del CUBE o la tapa del molde, para realizar el mismo experimento. Con una formación mínima, ambos lograron sembrar con precisión en un nivel similar al de un usuario experimentado, y con una precisión significativamente mayor en comparación con un usuario experimentado sin la tapa del molde (Figura complementaria 1).

un proceso de fabricación de CUBE (i) Diseños de CUBE para corte en parafina y crio. (ii) Proceso para adherir las paredes laterales de PDMS al dispositivo CUBE. b Proceso de siembra de células (i) Diseño de tapa de molde. (ii) Procese para sembrar células en el bolsillo de siembra creado por la tapa del molde en el hidrogel en el CUBO. c Proceso de fabricación Gradient-in-CUBE (i) Diseños de moldes para fabricar la tapa y base del chip. (ii) Proceso para fabricar chips PDMS a partir de moldes y adherir la tapa a la base mediante NSD, un sello adhesivo PDMS de doble cara. d Seccionamiento para imágenes. (i) Proceso para incrustar muestras en medio criogénico y seccionar con CUBE. (ii) Procese para incrustar muestras en parafina con el soporte CUBE y luego seccione con un borde marcado para mantener la orientación de la muestra.

Para establecer un gradiente a lo largo del CUBE, se diseñó y fabricó mediante un proceso de moldeo un chip Gradient-in-CUBE, que comprende un componente de base y un componente de tapa. El molde para la base contenía un compartimento para el CUBO y dos cámaras de medios separadas, así como una ranura para colocar la junta tórica; el molde para la tapa tiene dos puertos para agregar medios a las dos cámaras de medios separadas (Fig. 2c (i)). Los procesos para fabricar el chip se ilustran en la Fig. 2c (ii), (iii) y se describen en la sección de métodos, con una Película complementaria 1 que muestra cómo se integra el CUBE con el chip.

Se utilizaron FITC-dextrano y TRITC-dextrano para simular la adición de dos tipos diferentes de medios al CUBE, y se realizaron imágenes diarias para monitorear el progreso de la formación de gradiente dual en el CUBE durante un período de 5 días (Fig. 3a ). Se midió la concentración promedio (C) de FITC y TRITC en la región central de la ventana del CUBE (x – x'), y mostró un gradiente opuesto de alta concentración en el lado de la fuente a menor concentración en el lado del sumidero, como las respectivas moléculas de dextrano se mueven desde el lado donde está altamente concentrado, hacia el lado opuesto donde la concentración es mucho menor (Fig. 3b). Se agregaron 10 μM de dextrano al depósito de la fuente y la concentración máxima promedio en el extremo de la fuente del FOV fue FITC = 2,618 μM y TRITC = 3,255 μM, mientras que la mínima en el extremo del sumidero fue FITC = 0,024 μM y TRITC. = 0,026 µM. El gradiente se calculó como la relación de Ix0.2/Ix2.0 para FITC y Ix2.0/Ix0.2 para TRITC, donde un valor de uno no muestra gradiente y una relación más alta representa un gradiente más pronunciado (Fig. 3c). La pendiente del gradiente aumenta y alcanza su punto máximo durante las primeras 24 horas a medida que las moléculas comienzan a ingresar al gel, pero a medida que las moléculas se acumulan en el lado opuesto así como en el gel en el CUBO, la pendiente del gradiente disminuye para el día 2. Sin embargo, con un enjuague diario con DPBS y reemplazo con dextrano fresco, se puede mantener un gradiente constante durante 5 días sin que los medios alcancen un estado de equilibrio. En este estudio, sólo se utilizó la difusión de dextrano de 40 kDa en un gel de agarosa para modelar la difusión de factores de crecimiento en un hidrogel de ECM. Estos se eligieron sobre la base de que el peso molecular de Wnt, que desempeña un importante papel de señalización en el desarrollo, es de aproximadamente 40 kDa, y que el dextrano y la agarosa son reactivos fácilmente disponibles que se han utilizado en numerosos estudios de difusión y transporte de masas. Debido a la gran cantidad de gradientes de morfógenos conocidos con diferentes pesos moleculares y a la amplia variedad de hidrogeles disponibles para usar en cultivos celulares, no fue plausible investigar las diversas permutaciones de los pares de morfógenos e hidrogeles en el presente estudio.

a Imágenes del gradiente de dextrano FITC y TRITC que se forma durante un período de cinco días. Las imágenes se realizaron cada 24 horas después de que se retiró el dextrano usado, se lavó la cámara de medios con DPBS y se añadió dextrano fresco a la cámara. Las dimensiones de la ventana del CUBE fueron w = 2,75 mm; h = 3,5 mm y el campo de visión de la imagen con un aumento de 4x fue w = 3,6 mm; altura = 2,7 mm. Barra de escala = 1 mm. b La concentración, C, se determinó correlacionando linealmente la intensidad promedio a lo largo del eje y para cada píxel en la región central (w = 2,2 mm; h = 2,2 mm) de la imagen de fluorescencia de x a x' con la obtenida de un estándar Ajuste de curvas de concentraciones de FITC y TRITC-dextrano. Barra de escala = 1 mm. Los marcadores representan puntos de datos seleccionados cada 50 píxeles (~0,3 mm) y las líneas muestran los mínimos cuadrados lineales que mejor se ajustan; n = 5. Las pendientes de las líneas individuales para FITC fueron −0,0044 para el día 0, −0,5586 para el día 1, −0,5607 para el día 2, −0,5549 para el día 3, −0,5487 para el día 4 y −0,5391 para el día 5. Para TRITC, las pendientes fueron 0,0095 para el día 0, 0,7644 para el día 1, 0,7062 para el día 2, 0,6504 para el día 3, 0,5897 para el día 4 y 0,6039 para el día 5. El día 0 muestra poco gradiente, pero para el día 1 se observa un gradiente de concentración. generado desde un extremo del CUBO hasta el extremo opuesto para FITC y TRITC, respectivamente, en la dirección opuesta. c La relación entre la concentración del extremo de la fuente y la concentración del extremo del sumidero se tomó como una representación de la pendiente del gradiente. El área analizada fue de x = 0,2 mm a x = 2,0 mm como región aproximada en la que se ubicaría el esferoide. El gradiente fue más pronunciado el día 1, pero aunque disminuyó a partir del día 2, se puede mantener un gradiente consistentemente durante cinco días. d La diferenciación del esferoide hiPSC con medio inductor de mesodermo (M) en un lado y medio inductor de neuroectodermo (NE) en el lado opuesto da como resultado un esferoide con morfología diferente en cada extremo del esferoide, mientras que la morfología es relativamente uniforme en M o controles solo NE. Barra de escala = 500 μm.

Dado que un gradiente a lo largo de una escala de una o varias células es suficiente para proporcionar información posicional a las células32,33, postulamos que el gradiente generado en el chip Gradient-in-CUBE debería ser suficiente para inducir una diferenciación localizada en direcciones opuestas. Extremos de un esferoide. Además, otra estrategia para contrarrestar la acumulación de morfógeno es complementar inhibidores del morfógeno en el lado opuesto del gradiente, ya que la interacción entre el morfógeno y su inhibidor también es crítica para el modelado en tejidos in vivo. Por ejemplo, los antagonistas de Wnt y Nodal Dkk1, Lefty-1 y Cer-1 en las partes anteriores del embrión restringen Wnt/Nodal al extremo posterior del embrión para establecer el eje anteroposterior34.

Para demostrar la aplicación del chip Gradient-in-CUBE para diferenciar un solo esferoide en dos regiones localizadas, suministramos un medio de diferenciación de neuroectodermo (NE) a un extremo del CUBE y un medio de diferenciación de mesodermo (M) en el lado opuesto. El medio mesodermo (basado en un protocolo de Lam et al.35) contenía altas concentraciones de activador Wnt CHIR99021, mientras que el medio neuroectodermo (basado en un protocolo de Bianchi et al.36) contenía un activador Wnt inferior junto con el inhibidor Nodal/Activina SB431542. para contrarrestar la diferenciación del mesodermo en el lado del neuroectodermo. Después de 4 días de diferenciación, se pudieron observar diferencias morfológicas en ambos extremos del esferoide, con el lado del mesodermo teniendo una característica más protuberante y protuberante, en comparación con la característica más suave del lado del neuroectodermo. Por el contrario, los esferoides de control mostraron características morfológicas bastante uniformes: el control del mesodermo tenía protuberancias irregulares en toda la superficie; El control del neuroectodermo tenía una superficie más suave (Fig. 3d).

A menudo es difícil visualizar la expresión de pluripotencia celular o marcadores de diferenciación en muestras 3D a mayor escala, como organoides, debido al rango limitado de penetración del láser, así como a la baja sensibilidad de las lentes objetivas de bajo aumento y las distancias focales cortas de los de alta sensibilidad. lentes. Por lo tanto, los organoides a menudo se incluyen en medio criogénico o parafina y se cortan en secciones delgadas para teñirlos y obtener imágenes. Sin embargo, la orientación de la muestra a menudo se pierde después de recuperarla de los dispositivos generadores de gradiente predominantes. Las ventajas del dispositivo CUBE no son sólo que las células están contenidas dentro del CUBE y pueden recuperarse sin causar daños a la muestra, sino también que la orientación del gradiente se puede marcar fácilmente para reconocerlo más tarde. Aquí, mostramos que las muestras en CUBE se pueden procesar para corte criogénico y parafina.

Para el corte criogénico, el marco más grueso en un extremo del CUBO donde se adjuntó la junta tórica actúa como marcador de orientación. Después de recuperar la muestra del chip Gradient-in-CUBE, el CUBE simplemente se puede remojar en sacarosa y medio de inclusión criogénica antes de congelarlo. Una vez congelado, el CUBE se corta junto con la muestra, con el marco del CUBE y la pared exterior de PDMS actuando como referencia para preservar la orientación de la muestra (Figs. 2d (i) y 4a). A partir de la tinción por inmunofluorescencia del esferoide hiPSC diferenciado con gradiente NE-M, se observó la localización del marcador de neuroectodermo Sox2 y del marcador de mesodermo Brachyury en los respectivos extremos opuestos del esferoide, mientras que en las muestras de control, ambos marcadores se expresaron uniformemente en todo el esferoide (Fig. 4b). Por lo tanto, demostramos un método para preservar la información de orientación del esferoide diferenciado con gradiente de morfógeno al seccionar la muestra tal como está en el CUBO. Sin embargo, una desventaja de este método es que la hoja del micrótomo se daña al cortar repetidamente el material acrílico duro y es posible que sea necesario reemplazarla con frecuencia. Este problema se puede resolver utilizando un material más blando para el marco CUBE que sea más fácil de cortar, como policarbonato o teflón. Alternativamente, se podrían usar micrótomos de sierra o hojas recubiertas de diamante que se usan comúnmente para seccionar muestras duras como el hueso para cortar el marco CUBE.

a Cryo seccionamiento e imágenes. (i) Pasos para incrustar y seccionar muestras congeladas con CUBE, utilizando el marco CUBE como marcador de referencia para la orientación de la muestra. (ii) La inmunotinción del esferoide hiPSC diferenciado con gradiente M-NE mostró un patrón de expresión localizado de marcadores de mesodermo (Brachyury) y neuroectodermo (Sox2), mientras que los controles solo NE y solo M mostraron una distribución uniforme de los marcadores. b Corte en parafina e imágenes. (i) Pasos para incrustar y seccionar muestras de parafina con el soporte CUBE para evitar la pérdida de muestra, luego retirar la muestra del CUBE y cortar un borde de la muestra para marcar la orientación. (ii) La inmunotinción del esferoide hiPSC diferenciado con gradiente de endodermo (END) -NE mostró un patrón de expresión localizado de marcadores de endodermo (FoxA2) y neuroectodermo (Nestin), mientras que los controles solo NE y solo END mostraron una distribución uniforme de los marcadores.

Para el corte en parafina, se deben tomar algunos pasos adicionales para preservar la integridad y la orientación del gradiente de la muestra en el CUBO (Figs. 2d (ii) y 4b (i) y Fig. 2 complementaria). Si bien la sección con el CUBE se puede realizar con el crioCUBE, que está hecho de una combinación de marco acrílico y pared PDMS, que es un material blando, es mucho más difícil seccionar el CUBE de parafina, ya que todo el CUBE está hecho de acrílico. lo cual fue una modificación necesaria porque PDMS no es compatible con los solventes orgánicos utilizados en el proceso de inclusión en parafina. Durante el proceso de deshidratación inicial antes de la inclusión en parafina, el hidrogel pierde mucho volumen y se contrae en el CUBO. Para evitar el riesgo de perder la muestra que puede desprenderse del CUBE, se diseñó un soporte CUBE que comprende una tapa y una base para cubrir la mayor parte de las superficies abiertas superior e inferior del CUBE pero aún así permitir que los reactivos pasen dentro y fuera del CUBE. la muestra. Luego se ató el CUBO en el soporte con un alambre para mantenerlos juntos. Después del proceso de parafinización, la muestra se retiró del CUBE utilizando una plantilla de empuje y se marcó la orientación cortando un borde en una esquina de la muestra. Para demostrar la aplicación del método de parafina, el esferoide hiPSC se diferenció con medios de diferenciación NE y endodermo (END) (basado en un protocolo de Lam et al.35) en cada lado del CUBE. La tinción de inmunofluorescencia de los marcadores de neuroectodermo Nestin y Sox2, y los marcadores de endodermo FoxA2 y Sox17, mostraron localización en los lados NE y END de los esferoides, respectivamente (Fig. 4b (ii) y Fig. Suplementaria 3). Por otro lado, las muestras de control sin cultivo en gradiente mostraron una expresión uniforme de los marcadores en todo el esferoide.

Los experimentos de diferenciación FITC/TRITC-dextrano y NE/M, así como END/NE, demostraron aquí que se pueden generar gradientes de morfógeno en el CUBE y se pueden usar para controlar la diferenciación de esferoides celulares. Cabe señalar, sin embargo, que el gradiente generado por la plataforma presentada en este artículo se basa únicamente en la libre difusión de moléculas desde la fuente, a través del gel en el CUBO, hasta el sumidero. Como la velocidad de difusión libre depende del tamaño, la carga y la solubilidad del soluto37, así como del tamaño de los poros, la carga y la movilidad del polímero de la matriz del hidrogel38, se requieren estudios experimentales o de simulación detallados que tengan en cuenta las sustancias generadoras de morfogenos específicas. molécula, la difusividad de cada molécula y cómo las propiedades del hidrogel afectan la difusión de cada molécula39,40,41,42,43,44,45 puede ser necesario comprender los detalles minuciosos del transporte de masa para lograr un control aún más preciso de la generación de gradientes, pero este nivel de precisión está más allá del alcance de este estudio. Alternativamente, asegurar una concentración constante de factores de crecimiento en el medio es una manera de controlar mejor la precisión del gradiente, por ejemplo con cambios o mezclas más frecuentes del medio, o bombeando un flujo constante de medio fresco a la muestra, aunque Estos métodos aumentarían la complicación de los procedimientos de configuración y cultivo.

El papel y los mecanismos de los gradientes de morfógenos para guiar el destino celular son complejos y aún no se comprenden completamente. Cuando las células se autoorganizan para formar patrones específicos del tejido, tanto los gradientes locales generados por las secreciones de las propias células y las de sus vecinos inmediatos, como los gradientes externos en la MEC que rodean a las células generados por células que están más alejadas, como las aquellos en el mesénquima circundante contribuyen a gobernar la diferenciación celular15,16. Se han utilizado modelos teóricos como los de reacción-difusión, información posicional (bandera francesa) o síntesis-difusión-aclaración para explicar o predecir las interacciones de corto y largo alcance entre las células y el morfógeno y la formación de patrones resultantes29,45, 46, pero estos estudios se centran en el entorno local de las células. Por otro lado, la plataforma de gradiente CUBE tiene como objetivo imitar el suministro de gradientes externos por parte de otras poblaciones de células en la periferia que desempeñan un papel en la formación de estructuras de orden superior de órganos, como en los patrones de ramificación de la glándula mamaria, el riñón , o pulmón47,48,49. Por lo tanto, se requeriría una optimización detallada de la interacción entre las células y los gradientes de varios morfógenos, así como el momento de la formación del gradiente, para desarrollar organoides objetivo específicos con el patrón deseado. Además, aunque los factores de crecimiento agregados a ambos extremos de las muestras de control fueran exactamente los mismos, también existirían gradientes de los factores de crecimiento cuando ingresaron al gel desde los extremos opuestos, y es necesario realizar estudios a más largo plazo sobre cómo esto puede afectar la autoevaluación. -En el futuro sería necesaria la organización de células dentro de esferoides más grandes y más pequeños.

Como el CUBE y el diseño del chip de gradiente se pueden personalizar según las necesidades del usuario, la plataforma también podría ser aplicable para desarrollar organoides altamente complejos, como aplicar gradientes a los cuatro lados del CUBE para generar organoides con ejes anteroposterior y dorsal-ventral. .

Uno de los principales inconvenientes del uso de PDMS para fabricar el chip de gradiente es la absorción de proteínas y moléculas pequeñas en la superficie del PDMS debido a su naturaleza hidrofóbica50,51,52. A pesar de esto, PDMS tiene muchas ventajas, como biocompatibilidad, permeabilidad a los gases, transparencia óptica y un proceso de fabricación sencillo. También hay varios métodos relativamente simples que se ha informado que reducen la absorción de proteínas, incluida la mezcla de PDMS con polietilenglicol (PEG) para aumentar la hidrofilia de PDMS53 o el recubrimiento de superficies con teflón, polímero de 2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC) o parafina. cera54,55,56.

Aunque la tinción por inmunofluorescencia de los marcadores de diferenciación muestra una diferenciación localizada del esferoide, la estructura y morfología de cada muestra varían, como en el caso del control del endodermo en la Fig. 4b (ii). Una posible razón para esta variación es que, aunque se controla la posición del esferoide celular, el esferoide inicial se forma en una placa de 96 pocillos sin control de la forma del esferoide. Con varios estudios que informan la contribución de las restricciones geométricas en la imitación de patrones y eventos de ruptura de simetría del desarrollo en cultivos in vitro57,58, puede ser mejor aplicar el método de tapa de molde para colocar células individuales en hidrogel 3D antes de la formación de esferoides en el futuro para controlar la forma inicial de la siembra, por ejemplo imprimiendo en 3D la forma geométrica deseada con vidrio de carbohidratos y disolviendo el carbohidrato después de que el gel se haya curado para dejar una bolsa de siembra con la forma deseada correspondiente59.

Una ventaja de la modularidad del CUBE y del diseño del chip es que la elección del material se puede seleccionar de acuerdo con las necesidades de los experimentos. Por ejemplo, si la transparencia óptica es de alta prioridad, es más adecuado un CUBE con una ventana PDMS; mientras que si se requiere parafinar la muestra para el análisis post-experimento, es más adecuado un CUBE hecho completamente de acrílico sin PDMS, aunque la claridad óptica se reduce ligeramente, debido a la incompatibilidad del PDMS con disolventes orgánicos. En consecuencia, la elección del material para el chip de gradiente no tiene por qué ser la misma que la del CUBE, y debe elegirse teniendo en cuenta los pros y los contras del material60,61.

El cultivo de organoides 3D con gradiente de morfógeno ha sido durante mucho tiempo un desafío tanto en términos de la complicada configuración del dispositivo de gradiente como de mantener la orientación del gradiente durante los procesos de análisis. En este artículo, presentamos un flujo de trabajo de cultivo a imágenes en gradiente que utiliza el dispositivo de cultivo modular CUBE para configurar fácilmente un dispositivo de gradiente en CUBE. En comparación con los gradientes generados en chips de microfluidos estándar que se pueden controlar dinámicamente mediante flujo y presión, el gradiente generado con nuestro dispositivo de gradiente simple es menos controlable con el tiempo, ya que depende únicamente de la libre difusión de moléculas. Sin embargo, la plataforma presentada aquí se centra en la usabilidad para los biólogos y no requiere una configuración complicada que implique bombas o jeringas. Además, así como la versión anterior de CUBE se puso a disposición comercial, la comercialización de CUBE con varias modificaciones para adaptarse a los requisitos de los usuarios aumentaría aún más la usabilidad y la adopción de la plataforma CUBE por parte de laboratorios menos inclinados a la ingeniería. Además, después del experimento, la muestra se puede extraer fácilmente del dispositivo sin dañarla y al mismo tiempo conservar información sobre la dirección en la que se formó el gradiente. Aunque puede ser necesaria una optimización adicional de los protocolos de cultivo dependientes de los organoides objetivo para determinar las pendientes de gradiente más adecuadas para factores de crecimiento específicos en el material ECM de soporte elegido, las metodologías sencillas y personalizables de este documento tienen el potencial de avanzar significativamente en el desarrollo de organoides mediante la ruptura de la simetría. .

Un punto interesante a considerar en futuros trabajos, sin embargo, es la posible contribución de las diferencias en la estimulación mecánica que experimentan las células dependiendo del tamaño de los esferoides en relación con el tamaño de la bolsa de siembra creada por la tapa del molde, como el sellado de la El bolsillo con hidrogel adicional puede introducir alguna variación en la rigidez del gel debido al exceso de medio en el bolsillo cuando se siembran esferoides en él. La plataforma Gradient-in-Cube en su forma actual solo genera gradiente en una dirección, pero también tiene el potencial de adaptarse para generar gradientes en dos ejes, por ejemplo, los ejes anteroposterior y dorsal-ventral en el mismo organoide. , que es un trabajo que se está realizando actualmente. Por lo tanto, el flujo de trabajo desde la generación de organoides con diferenciación localizada hasta el análisis con información de gradiente podría proporcionar a los investigadores un método fácil de usar para desarrollar organoides cada vez más complejos y ampliar nuestra comprensión de diversos mecanismos, como la ruptura de la simetría, que están involucrados en los procesos de desarrollo.

Las iPSC humanas (IMR90-4; WiCell Research Institute; WB65317) se mantuvieron con mTeSR Plus (STEMCELL Technologies, 100-0276) en placas recubiertas con Matrigel reducido con factor de crecimiento de 9 a 10 μg/cm2 (Corning, 356231), pasadas de forma rutinaria utilizando ReLeSR. (STEMCELL Technologies, 05872) y se cultivaron en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2. Las células se analizaron para detectar contaminación por micoplasma utilizando el kit MycoAlert (Lonza, LT07-118). Para preparar placas de 96 pocillos para la formación de esferoides, los pocillos se llenaron con 80 µl/pocillo de agarosa al 3 % (Sigma, A9414) y se dejaron solidificar. Luego se añadió al pocillo medio StemFit AK02N (Ajinomoto, RC AK02N) más inhibidor de Rock 10 μM (Y-27632; Nacalai Tesque, 08945-84) y se incubó. Para la formación de esferoides, se disociaron el 70% de las células confluentes utilizando ReLeSR y se resuspendieron en medio StemFit +Y27632 después de la centrifugación, antes de sembrarlas en una placa de pocillos de agarosa. Se utilizaron células de una placa de 35 mm para formar 5 esferoides (aproximadamente 2 a 3 × 104 células por esferoide). Al día siguiente, el medio se cambió a medio mTeSR Plus sin Y27632. Los esferoides se transfirieron al dispositivo CUBE después de un día de cultivo en mTeSR Plus.

La elección del material para CUBE tuvo que considerarse cuidadosamente para adaptarse a los requisitos de cada procedimiento, especialmente porque el proceso de parafinización implica el uso de reactivos orgánicos. La estructura CUBE se cambió del policarbonato utilizado anteriormente al material acrílico, que es más resistente al tratamiento con xileno durante períodos cortos de tiempo en comparación con el policarbonato. Además, se utilizó polidimetilsiloxano (PDMS), un material biocompatible transparente a base de silicona, como material de la pared lateral para restringir el movimiento de los medios que contienen morfógenos a través del CUBE solo a los lados superior e inferior del CUBE, generando así un gradiente en un solo eje. del CUBO.

Para este estudio se diseñaron dos tipos de CUBE acrílicos (poli (metacrilato de metilo); PMMA utilizando el software Rhinoceros 3D (Robert McNeel & Associates). Para el corte criogénico, los CUBE se diseñaron con un marco más grueso en la parte superior del cubo para que se pueda conectar una junta tórica de nitrilo (AS ONE, 62-3049-63) al cubo (Fig. 2a (i)) para Sellado hermético para reducir la fuga de medios alrededor del cubo durante el cultivo en gradiente. Para fabricar las paredes laterales del Cryo CUBE, primero se preparó PDMS (Silpot 184, Dow Toray, 04133124) mezclando una base de elastómero con un reactivo de curado en una proporción de 10:1. Luego, se extendió una fina capa de la mezcla en una placa de Petri y se desgasificó para eliminar las burbujas de aire. Los marcos de cubos se colocaron sobre el PDMS, luego se desgasificaron nuevamente y se hornearon a 85 °C durante 30 minutos para curar el PDMS. Una vez curado, se recortó el PDMS de los marcos con un bisturí y se repitió el proceso para cubrir los otros tres lados del cubo, dejando las superficies superior e inferior abiertas (Fig. 2a (ii)). El espesor de la pared de PDMS es equivalente al espesor del marco CUBE, que es de 0,75 mm cuando se utilizaron ~2,8 g de PDMS por plato de 100 mm. Debido a que el PDMS se hincha cuando se expone al xileno, los CUBE para el corte en parafina se diseñaron sin paredes laterales (Fig. 2a (i)). Aunque esto reduce ligeramente la claridad de las muestras, un marco completamente acrílico aún brinda suficiente visibilidad en campo claro. Para el seccionamiento de parafina, los CUBE se diseñaron como un cubo sólido de 5 mm de longitud con un núcleo hueco de 3,5 × 3,5 mm, con un espesor del marco de 0,75 mm (Fig. 2a (i)). Los CUBE para el corte en parafina no tenían paredes laterales de PDMS, ya que el PDMS se hincha en xileno durante el proceso de parafinización. Todos los CUBE se encargaron a empresas de mecanizado (Cryo CUBE de Yumoto Electric Inc, Japón, y Paraffin CUBE de Proto Labs, Japón). Antes de su uso, los CUBE se lavaron dos veces con ultrasonidos, una vez con agua MilliQ y otra con isopropanol (IPA), luego se secaron en el horno durante 2 h.

Para controlar la posición de las células durante la siembra inicial en el CUBE, se diseñó una tapa de molde con una estructura de pilar en la posición de siembra deseada y con ranuras para asegurar que el molde encaje en la parte superior del cubo para que la posición del pilar pueda alinearse. correctamente en el cubo (Fig. 2b (i)). Las tapas de los moldes se imprimieron usando una impresora 3D (Agilista 3200, Keyence) y se limpiaron mediante ultrasonidos dos veces con IPA después de eliminar el exceso de material de soporte de impresión, luego se secaron en un horno a 65 °C. Antes de su uso, la tapa del molde se sumergió en 2-metacriloiloxtetilfosforilcolina (MPC; Lipidure, NOF Corporation, CM5206E) diluida al 5% en isopropanol y luego se dejó secar durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). El recubrimiento MPC ayuda a garantizar un desprendimiento más suave del molde del hidrogel. Se colocó una junta tórica de nitrilo en la parte gruesa del marco acrílico del Cryo CUBE, o aproximadamente 1 mm cerca de un extremo del Paraffin CUBE. Los CUBE se colocaron con la junta tórica hacia abajo en un plato y se añadió Matrigel al CUBE antes de colocar la tapa del molde encima del CUBE y curar el gel en la incubadora durante 25 minutos. Una vez que el gel se curó, se quitó la tapa del molde y se sembraron esferoides de hiPSC en el bolsillo creado por el molde. A continuación, se añadió Matrigel adicional a la parte superior del CUBE y se dejó curar durante otros 25 minutos para sellar el bolsillo (Fig. 2b (ii)). Después del curado, el CUBE se transfirió a una placa de 48 pocillos con medio mTeSR Plus y se incubó durante 2 h antes de iniciar el cultivo en gradiente.

Los moldes para hacer la tapa de los chips de gradiente PDMS se diseñaron con ranuras para adaptarse a la junta tórica y puertos para agregar medios, mientras que la base se diseñó para adaptarse al cubo, la junta tórica y dos cámaras de medios separadas (Fig. 2c (i) ). Los moldes PDMS se encargaron a Proto Labs. Para fabricar los chips de PDMS, se vertió PDMS sin curar en los moldes, luego se desgasificó y se horneó a 85 °C durante 1 h para curar el PDMS. Una vez curadas, las virutas se retiraron de los moldes, luego se lavaron y esterilizaron de la misma manera que los CUBE. Para ensamblar el chip de gradiente, se colocaron CUBE en la base del chip con la junta tórica colocada en la ranura de la junta tórica y se cortó una película adhesiva de doble cara PDMS (NSD-100, NIPPA) con orificios para acceder a las cámaras de medios. se usó para sellar la tapa y la base (Fig. 2c (ii)). Después del ensamblaje, las cámaras de medios a cada lado del CUBO se llenaron con los respectivos medios de diferenciación (Fig. 2c (iii)).

El medio de diferenciación de neuroectodermo comprendía una mezcla 1:1 de KnockOut DMEM/F12 (Gibco, 12660-012) y medio Neurobasal (Gibco, 21103-049) suplementado con un 10% de reemplazo de suero KnockOut (Gibco, 10828010), un 1% de aminoácidos no esenciales de MEM. ácido (Nacalai Tesque, 06344-56), GlutaMAX al 1 % (Gibco, 35050-061), LDN1913189 1 μM (Sigma, SML0559), SB431542 2 μM (Nacalai Tesque, 18176-54), CHIR99021 3 μM (Nacalai Tesque, 18764) -44), 2-mercaptoetanol 0,1 mM (Nacalai Tesque, 21438-82) y ácido ascórbico 0,5 μM (Nacalai Tesque, 03420-52). El medio basal de mesendodermo comprendía medio RPMI 1640 (Gibco, 11875-093), 1 % de GlutaMAX y 1 % de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15140122). Para la diferenciación del mesodermo, se añadió CHIR99021 5 µM al medio basal del mesendodermo los días 0 y 1. De los días 2 a 4, se retiró CHIR99021 y se reemplazó con bFGF 100 ng/ml (Nacalai Tesque, 19155-36) y todo-trans 1 µM. ácido retinoico (Stemgent, 04-0021). Para la diferenciación del endodermo, se añadió CHIR99021 5 µM al medio basal de mesendodermo el día 0, y de los días 2 a 5 se retiró CHIR99021 y se reemplazó con 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, 338-AC-050/CF). El cambio de medio se realizó todos los días desechando el medio gastado, lavándolo una vez con DPBS y reemplazándolo con medio nuevo. Se tomaron imágenes de contraste de fase de los esferoides en el CUBE en el dispositivo de chip utilizando el microscopio Olympus CKX41 para monitorear los cambios morfológicos del esferoide.

En el momento adecuado para el análisis, las muestras se retiraron del chip de gradiente y se transfirieron a una placa de 48 pocillos para su fijación. Las muestras se lavaron dos veces con DPBS durante 5 minutos cada vez, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y luego se lavaron dos veces con DPBS durante 10 minutos cada vez. Para el corte criogénico, las muestras se empaparon en sacarosa al 10 %, 15 % y 20 % (Wako, 194-00011) sucesivamente durante 1 h cada una, y en medio de inclusión de criosección (compuesto Tissue-Tek OCT; Sakura Finetek, 4583) para 10 min antes de incluir en medio de inclusión y congelar a -80 °C durante 30 min. Después de la congelación, las muestras se retiraron del molde y se seccionaron con un espesor de 30 μm tal como está con el CUBE (Fig. 2d (i)) utilizando un micrótomo (Yamato Kohki Industrial, Retoratome REM-710) equipado con una unidad de congelación (Yamato Kohki Industrial). , Electrocongelación MC-802A). Las secciones recogidas en portaobjetos de vidrio se secaron con aire frío durante 30 minutos, luego en un horno a 40 °C durante otros 30 minutos, seguido de lavado en agua MilliQ para eliminar el exceso de medio de inclusión. Se eliminó el exceso de agua y las secciones se secaron a temperatura ambiente durante 10 min.

Para el corte en parafina, las muestras se deshidrataron y se incluyeron en parafina con el siguiente procedimiento: 70% de etanol durante 2 h, 70% de etanol durante la noche, 80% de etanol durante 1 h, 95% de etanol durante 1 h, 99% de etanol durante 1 h, 100 % de isopropanol durante 1 h dos veces, 100 % de xileno durante 1 h tres veces, mezcla 1:1 de xileno y parafina (Nacalai Tesque, 26029-05) durante la noche a 40 °C y parafina durante 1,5 h tres veces a 65 °C. Para evitar la pérdida de muestra debido a la contracción de Matrigel durante el proceso de deshidratación, se diseñó un soporte CUBE con tapa y base unidas por alambre para contener la muestra en el CUBE (Fig. 2d (ii)). Después del paso final de parafina, la muestra se retiró del soporte CUBE y se incluyó en parafina nueva. El CUBO se cortó de la parafina y la muestra se retiró del CUBO cortando la parafina a lo largo del marco interior del CUBO con un bisturí y presionando el CUBO sobre una plantilla de empuje (Fig. 2d (ii)). Se cortó un borde de la muestra parafinada para marcar la orientación de la dirección del gradiente y la muestra se seccionó en rodajas de 10 μm de espesor utilizando un microtomo. La desparafinización se realizó de la siguiente manera: 100% xileno durante 10 min dos veces, 99% etanol durante 5 min dos veces, 95% etanol durante 5 min, 80% etanol durante 5 min, 70% etanol durante 5 min, agua MilliQ durante 5 min. La recuperación de antígeno inducida por calor se realizó colocando las muestras en tampón citrato 10 mM (ácido cítrico 1,8 mM, citrato trisódico 8,2 mM, pH 6) y calentando el tampón hasta que hierva, luego enfriándolo durante 1 min. El proceso de ebullición y enfriamiento se repitió 6 veces con 10 s de ebullición seguido de 1 min de enfriamiento. Después del último ciclo, las muestras se enfriaron durante 30 minutos, luego se lavaron con agua MilliQ durante 5 minutos, seguido de DPBS durante 5 minutos tres veces.

Las muestras crioseccionadas se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% durante 10 minutos, seguido de tres lavados con glicina 100 mM durante 10 minutos cada vez. El tampón de inmunofluorescencia (tampón IF) estaba compuesto por 0,5 % de Tween20, 2 % de Triton X-100 y 10 % de albúmina sérica bovina (BSA; Sigma, 126615) en DPBS. El bloqueo se realizó incubando muestras con tampón IF con suero de cabra al 10 % (Gibco, 16210064) (IF + G) durante 30 min, luego IF + G con IgG anti-ratón de cabra al 1 % (Byl Laboratories, A90-116A) durante 20 min. mín. Los anticuerpos se diluyeron (1:200 o 1 μg/ml) de acuerdo con la Tabla complementaria 1. Los anticuerpos primarios se incubaron durante 90 minutos y los anticuerpos secundarios (Alexa fluor, 1:200, Thermo Fisher Scientific)) se incubaron durante 50 minutos. Después de cada incubación de anticuerpos, las muestras se lavaron con tampón IF durante 15 minutos tres veces. Los núcleos se tiñeron con DAPI durante 20 min y luego se lavaron con DPBS durante 5 min tres veces.

Para rastrear la formación del gradiente durante un período de tiempo, se colocó un CUBO lleno con agarosa al 1,5% en el chip de gradiente con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (Sigma, FD40S) 10 μM de 40 kDa en un extremo del CUBE. y isotiocianato de tetrametil rodamina B (TRITC) -dextrano (TdB Labs, TD40) 10 μM de 40 kDa en DPBS en el otro extremo. Cada 24 h, se descartaron tanto FITC-dextrano como TRITC-dextrano, y las cámaras de medios se lavaron una vez con DPBS antes de reemplazarlas con dextrano fresco. Siguiendo estos pasos, se realizaron imágenes en la ventana del CUBE (w = 2,75 mm; h = 3,5 mm) utilizando un microscopio de fluorescencia (BZX-700, Keyence) con un aumento de ×4 (campo de visión: w = 3,6 mm; h = 2,7 milímetros). El área de la ventana del CUBE estaba a 1,5 mm de la fuente en el lado FITC y a 0,75 mm de la fuente en el lado TRITC en x; 0,75 mm de distancia de la pared CUBE en y; y 2,5 mm desde la parte inferior del CUBO en z. Las intensidades de FITC y TRITC se midieron a partir de imágenes de fluorescencia utilizando la herramienta Plot Profile en el software ImageJ sobre un área en el centro de la imagen (w = 2,2 mm; h = 2,2 mm), lo que proporciona la intensidad promedio a lo largo del eje y vertical para cada píxel en el eje x. Luego se calculó la concentración (C) mediante correlación lineal con una curva estándar de intensidades de dextrano FITC y TRITC de varias concentraciones (Datos complementarios 1). El gradiente se calculó como la relación de la concentración a 0,2 mm y a 2,0 mm (Cx0,2/Cx2,0 para FITC y Cx2,0/Cx0,2 para TRITC) para excluir las regiones en ambos extremos de la ventana CUBE. ya que la proximidad al marco CUBE afectó la intensidad del dextrano y representó la región aproximada del esferoide.

Todos los tamaños de muestra son mayores que cinco y se especifican en las leyendas de las figuras. El valor de p se calculó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (KS) en Matlab.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos de origen subyacentes a la Fig. 3c y la Fig. 1c complementaria se proporcionan en los Datos complementarios 1.

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Esta investigación fue financiada con fondos de las subvenciones JSPS KAKENHI números 21H01299 y 21K18048. Algunas ilustraciones fueron generadas usando Biorender.

Clúster de investigación pionera, RIKEN, Saitama, 351-0198, Japón

Isabel Koh y el rey Hagiwara

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IK y MH concibieron el estudio, diseñaron y realizaron experimentos y analizaron los resultados. IK escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito enviado.

Correspondencia con Masaya Hagiwara.

Los autores poseen las siguientes patentes: (i) Relativas al dispositivo CUBE - Aprobadas: 6877009 (Japón), US 11,155,775 B2 (EE. UU.); Pendiente: 201680069487.6 (China); Solicitante: Universidad Metropolitana de Osaka y Instituto de Tecnología de Kyushu; Inventores: Masaya Hagiwara y Tomohiro Kawahara, (ii) Relativo al dispositivo CUBE y al dispositivo fluídico - Aprobado: 7055386 (Japón); Pendiente: 16/484.506 (EE.UU.), 16/484.506 (EP); Solicitante: Universidad Metropolitana de Osaka; Inventor: Masaya Hagiwara, (iii) Relativo a la sección del dispositivo CUBE - Pendiente: 2022-140997 (Japón); Solicitante: RIKEN; Inventores: Masaya Hagiwara, Isabel Koh. La patente 6877009 tiene licencia para Nippon Medical & Chemical Instruments Co., Ltd.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Marco Fritzsche, Manuel Breuer.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Koh, I., Hagiwara, M. Gradiente para seccionar el flujo de trabajo de CUBE para la generación e imágenes de organoides con diferenciación localizada. Común Biol 6, 299 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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Recibido: 27 de septiembre de 2022

Aceptado: 10 de marzo de 2023

Publicado: 21 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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